Identificación y cuantificación de proteínas plasmáticas en suero

Identificación y cuantificación de proteínas plasmáticas en suero

 Objetivo:

 En esta práctica vamos a identificar y cuantificar las proteínas plasmáticas que tenemos en una muestra de suero. Nos basamos en el principio de que las proteínas, moléculas anfóteras, en medio básico adquieren una carga global negativa que hace que migren del cátodo hacia el ánodo cuando son cometidas a un proceso electroforético y en función de su migración tras este proceso, podremos clasificar las sustancias que estamos estudiando

Materiales:

- Alimentador para electroforesis
- Cubeta de electroforesis
- Aplicador
- Tiras de acetato de celulosa
- Láminas Mylar
- Papel de filtro

- Instrumentos habituales de laboratorio

Reactivos:

- Solución tampón ( Tris Hipurato)
- Colorante rojo Ponceau
- Decolorante rojo Ponceau (ácido acético al 5%)
- Solución transparentadora
- Solución disolvente (ácido acético al 80%)

 Procedimiento:

 ·1: Tenemos que preparar los reactivos que vamos a emplear a lo largo de toda la práctica; lo primero es preparar el tampón, 100 ml de Tris Hipurato para 1000 mL de agua destilada. y después haremos el decolorante empleando ácido acético. Prepararemos una dilución de 1000 ml de ácido acético al 5%

 ·2: Ahora introduciremos las tiras en la cubeta de tampón y la agitamos durante 10 minutos

 ·3: Luego llenaremos completamente un compartimento de la cámara con el tampón y nivelamos ambos compartimentos. Haciendo así la cámara de electroforesis

 ·4: Ponemos estas tiras entre dos papeles del filtro para que se seque totalmente

 ·5: A continuación aplicamos la muestra en la tira con el aplicador, durante unos 10 segundos, situado a unos 2 cm del borde cercano al polo negativo y tapamos la cámara. Ponemos la fuente de alimentación a 200V y lo dejamos 35 minutos

 ·6: Después tenemos que tintar las tiras; para ello las metemos en la cubeta del colorante durante un breve momento y de momento lo pasamos hasta por 3 cubetas diferentes, hasta que el fondo quede transparente

 ·7: Una vez concluida la tinción, sumergimos las tiras en el líquido transparentador durante 1 minuto. Después sacamos la tira y la colocamos sobre una lámina Mylar

 ·8: Por último calentamos la tira en una estufa a 80ºC durante 10 minutos

 Resultado:

 Ahora que hemos finalizado la práctica, podremos leer los resultados obtenidos empleando el fotodensitómetro. Este aparato dará un valor total, correspondiente al total de proteínas.
Después cada pico, correspondiente a cada fracción proteica, nos dará un nuevo valor.
Ahora dividimos el resultado que nos ha salido en cada pico entre el valor total y obtenemos el porcentaje de cada fracción en la muestra

 Galería: