Determinación de Hb A1c por cromatografía de intercambio iónico

 Objetivo:

En esta práctica vamos a preparar un hemolizado , donde se elimina la fracción lábil y las hemoglobinas son retenidas por una resina de intercambio catiónico , eluyendose de forma específica la hemoglobina A1c previa eliminación por lavado de HbA. Con el fin de poder ver el porcentaje de Hb A1c que tiene la muestra que estamos estudiando; hallando los datos para calcular gracias a la absorbancia.

 Materiales:

 -Columnas de intercambio iónico

 -Tubos de ensayo

 -Muestra de sangre con anticoagulante EDTA

 -Pipetas y puntas.

 -Cubetas de espectrofotometría

 -Espectrofotómetro

 Procedimiento:

 ·1: Primero hay que dejar que las muestras y reactivos se atemperen, mientras tanto cogeremos nuestra columna y la pondremos boca abajo para que la resina de la que está compuesta la fase estacionaria no se quede compactada

 ·2: Después hemolizar la muestra de sangre, para que pueda desprenderse la hemoglobina contenida en su interior. Por lo que cogeremos 50  μL de sangre y 200  μL del reactivo 1. Lo agitamos y lo dejamos unos 10 minutos. consiguiendo así nuestro lisado

 ·3: Ahora, ponemos la columna en su posición correcta, dejándola reposar un rato para que la resina vuelva a su posición normal y se despegue del disco que contiene la columna

 ·4: A continuación, cuando se pueda observar este disco, bajaremos el disco que contiene y lo pegaremos hasta que esté en contacto con la resina. De momento  romperemos la punta inferior de la columna, para que salga todo el líquido que contiene y eliminarlo más tarde. Una vez se hayaquitado todo este, depositamos sobre el disco 50 μL del hemolizado.

 ·5: Cuando haya penetrado todo el hemolizado añadiremos 200 μL del reactivo 2, intentando arrastras posibles restos de antes y desechamos el eluido, y pipeteamos 2 (mL) del reactivo 2, dejamos que se filtre todo el volumen y desechamos el eluyente

 ·6: Despegamos la Hb glicosilada de la columna y la depositamos en un tubo de ensayo, cogiendo 4 mL de reactivo 3 y lo depositamos en la columna, quedándonos esta vez con el eluyente, ya que ahí estará presente la hemoglobina glicosilada objetivo de estudio

 ·7: Ahora tenemos que preparar el patrón que vamos a usar en el espectrofotómetro, mientras que el líquido que contiene la hemoglobina glicosilada va cayendo en el tubo de ensayo.

 Cogemos 12 mL de reactivo 3 y 50μL de hemolizado, esta muestra esta demasiado concentrada, por lo que tenemos que diluirla para que cumpla la ley de Lambert-Beer

 Resultado:

 Ahora que ya tenemos todo el procedimiento realizado, debemos medir con el espectrofotómetro , con una longitud de onda de 415 nm. Previamente tenemos que hacer un blanco con agua destilada, para eliminar las impurezas. Ahora que hemos medido las absorvancia nos dan estos datos:

- A. muestra = 0.249 nm
- A. patrón= 0.642 nm

 Y con estos datos tenemos que calcular el porcentaje de hemoglobina glicosilada de la muestra siguiendo la fórmula

(A. muestra/ 3x A. patrón) x100 = % Hb A1c
(0.249/ 3x 0.642) x100 = 12.93%

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