Prácticas de bioquímica: Manejo De Espectrofotómetro

Manejo De Espectrofotómetro

Objetivo:

En esta práctica vamos a realizar una batería de dilución seriada (práctica que ya hicimos el primer año) con el objetivo de usar después cada disolución una a una en el espectrofotómetro para poder calcular su observancia, además conociendo la concentración proporcionada por el protocolo podremos realizar la curva de calibración

Además usaremos un programa de ordenador especial para la realización de la curva con el fin de poder ver como se hace esta técnica en un laboratorio normal. Dicho programa se llama “ Jasco V-530”.

Además aprovechando la práctica de la batería de disoluciones podremos recordar métodos de trabajo cotidianos como son la técnica de pipeteo, enrasado…

Materiales:

- Erlenmeyer con cromógeno 1 (Azul) cuya concentración es de 800 mg/dL

- Erlenmeyer con cromógeno 2 (Rojo) cuya concentración es de 600 mg/dL

- Agua destilada

- Pipetas manuales

- Tubos de ensayos

- Cubetas de espectrofotómetro

- Espectrofotómetro de absorción

Procedimiento:

-1: En primer lugar tenemos que elaborar la batería de diluciones seriadas.

1.1. Para ello lo primero que haremos es calcular el volumen de paso para saber que cantidad hay que pasar de un tubo a otro; recurriendo a la formula aprendida.

1.2. Una vez calculado ese volumen preparamos todos los tubos que necesitamos para cada una de las disoluciones con cromógenos. Emplearemos 5 tubos para el azul, con 4 mL cada uno y 4 para el rojo, con 3 mL para cada uno de agua destilada.

1.3. Llenamos el primer tubo y vamos haciendo el volumen de paso con cada uno quedando así cada vez más diluido las disoluciones y con un color más clarito progresivamente.

1.4. Por último desechamos el volumen de paso final, unicamente por estética

- 2: Ahora tenemos que coger el espectrofotómetro para poder medir la absorvancia de cada uno de los tubos.

2.1. En primer lugar tenemos que medir la observancia del blanco (disolución total pero sin el soluto que queremos calcular, esto podríamos considerar que es una tara ya que eliminamos los datos que queremos desechar)

2.2. Ahora vamos cogiendo cada tubo por orden y vamos midiendo la absorvancia uno a uno para poder realizar la curva deseada

2.3. Antes de comenzar a medir tenemos que poner la longitud de onda empleada la cual la proporciona el protocolo; recordemos que hay que cambiar la longitud de onda entre el el colorante rojo y azul ya que no es la misma

- 3: Por último ya que conocemos la absorvancia de cada muestra y la concentración podremos realizar sin ningún problema la curva

3.1. Tras haber hecho la curva podremos saber la concentración de cualquier muestra que tenga la misma longitud de onda que el patrón, con el hecho de tener tan solo la concentración.

De esta forma habremos realizado la curva de calibración a mano; no obstante también la podemos hacer con el ordenador empleando el programa de ordenador “Jasco V-530” , se hace de la misma forma que ya hemos mencionado la única diferencia que nos proporciona la curva directamente y nos da la opción de imprimir esta gráfica

Datos:

En esta tabla podemos ver los datos recogidos por el espectrofotómetro tras medir cada tubo de la disolución seriada