Identificación y cuantificación de proteínas plasmáticas en suero

Identificación y cuantificación de proteínas plasmáticas en suero

 Objetivo:

 En esta práctica vamos a identificar y cuantificar las proteínas plasmáticas que tenemos en una muestra de suero. Nos basamos en el principio de que las proteínas, moléculas anfóteras, en medio básico adquieren una carga global negativa que hace que migren del cátodo hacia el ánodo cuando son cometidas a un proceso electroforético y en función de su migración tras este proceso, podremos clasificar las sustancias que estamos estudiando

Materiales:

- Alimentador para electroforesis
- Cubeta de electroforesis
- Aplicador
- Tiras de acetato de celulosa
- Láminas Mylar
- Papel de filtro

- Instrumentos habituales de laboratorio

Reactivos:

- Solución tampón ( Tris Hipurato)
- Colorante rojo Ponceau
- Decolorante rojo Ponceau (ácido acético al 5%)
- Solución transparentadora
- Solución disolvente (ácido acético al 80%)

 Procedimiento:

 ·1: Tenemos que preparar los reactivos que vamos a emplear a lo largo de toda la práctica; lo primero es preparar el tampón, 100 ml de Tris Hipurato para 1000 mL de agua destilada. y después haremos el decolorante empleando ácido acético. Prepararemos una dilución de 1000 ml de ácido acético al 5%

 ·2: Ahora introduciremos las tiras en la cubeta de tampón y la agitamos durante 10 minutos

 ·3: Luego llenaremos completamente un compartimento de la cámara con el tampón y nivelamos ambos compartimentos. Haciendo así la cámara de electroforesis

 ·4: Ponemos estas tiras entre dos papeles del filtro para que se seque totalmente

 ·5: A continuación aplicamos la muestra en la tira con el aplicador, durante unos 10 segundos, situado a unos 2 cm del borde cercano al polo negativo y tapamos la cámara. Ponemos la fuente de alimentación a 200V y lo dejamos 35 minutos

 ·6: Después tenemos que tintar las tiras; para ello las metemos en la cubeta del colorante durante un breve momento y de momento lo pasamos hasta por 3 cubetas diferentes, hasta que el fondo quede transparente

 ·7: Una vez concluida la tinción, sumergimos las tiras en el líquido transparentador durante 1 minuto. Después sacamos la tira y la colocamos sobre una lámina Mylar

 ·8: Por último calentamos la tira en una estufa a 80ºC durante 10 minutos

 Resultado:

 Ahora que hemos finalizado la práctica, podremos leer los resultados obtenidos empleando el fotodensitómetro. Este aparato dará un valor total, correspondiente al total de proteínas.
Después cada pico, correspondiente a cada fracción proteica, nos dará un nuevo valor.
Ahora dividimos el resultado que nos ha salido en cada pico entre el valor total y obtenemos el porcentaje de cada fracción en la muestra

 Galería:

Determinación de proteínas totales por el método de Biuret

Determinación de proteínas totales por el método 

de Biuret

 Objetivo:

En esta práctica vamos a determina las proteína que hay en una muestra, a través de un nuevo método; denominado método de Biuret. Los grupos _CO-NH- unidos entre sí dan una reacción con formación de color violeta con las sales cúpricas en medio alcalino, siendo la más representativa y simple la que da con el Biuret-NH2-CO-NH-CO-NH2. Es en la actualidad el método colorimétrico más exacto y simple para determinar las proteínas totales

 Materiales:

- Reactivo de Biuret
- Patrón
- Muestra (suero o plasma)
- Tubos de 3mL
- Cubetas de espectrofotometría
- Espectrofotómetro

- Equipamiento de laboratorio habitual

Procedimiento:

 ·1:Primero tenemos que rotular los tubos de ensayos de forma que; uno como blanco, otro como patrón y el último como muestra y pipetearemos en cada uno las siguientes cantidades:

 ·2: Ahora tenemos que incubar los tubos a 5 minutos a 37ºC; pero hay que controlar muy bien el tiempo, ya que si nos pasamos del tiempo, los reactivos se van degradando y nos otorgará falsos resultados

 ·3: Ahora podemos sacar los tubos del baño maría y ya podemos cuantificar la absorbancia con el espectrofotómetro

 Resultado:

 Una vez que tenemos listos los tubos de ensayos, tenemos que poner  el aparato a 540 nm y realizar un blanco. Recopilamos los datos y vemos que nos da los siguientes resultados:

 - A. patrón= 0.468 nm
 - A. muestra= 0.492 nm
Realizamos el siguiente cálculo:
(A. muestra/ A. patrón) x7= g/ dL de proteínas totales
 
(0.492/ 0.468) x7= 7.36 g/ dL

 Galería:

Determinación de Hb A1c por cromatografía de intercambio iónico

 Objetivo:

En esta práctica vamos a preparar un hemolizado , donde se elimina la fracción lábil y las hemoglobinas son retenidas por una resina de intercambio catiónico , eluyendose de forma específica la hemoglobina A1c previa eliminación por lavado de HbA. Con el fin de poder ver el porcentaje de Hb A1c que tiene la muestra que estamos estudiando; hallando los datos para calcular gracias a la absorbancia.

 Materiales:

 -Columnas de intercambio iónico

 -Tubos de ensayo

 -Muestra de sangre con anticoagulante EDTA

 -Pipetas y puntas.

 -Cubetas de espectrofotometría

 -Espectrofotómetro

 Procedimiento:

 ·1: Primero hay que dejar que las muestras y reactivos se atemperen, mientras tanto cogeremos nuestra columna y la pondremos boca abajo para que la resina de la que está compuesta la fase estacionaria no se quede compactada

 ·2: Después hemolizar la muestra de sangre, para que pueda desprenderse la hemoglobina contenida en su interior. Por lo que cogeremos 50  μL de sangre y 200  μL del reactivo 1. Lo agitamos y lo dejamos unos 10 minutos. consiguiendo así nuestro lisado

 ·3: Ahora, ponemos la columna en su posición correcta, dejándola reposar un rato para que la resina vuelva a su posición normal y se despegue del disco que contiene la columna

 ·4: A continuación, cuando se pueda observar este disco, bajaremos el disco que contiene y lo pegaremos hasta que esté en contacto con la resina. De momento  romperemos la punta inferior de la columna, para que salga todo el líquido que contiene y eliminarlo más tarde. Una vez se hayaquitado todo este, depositamos sobre el disco 50 μL del hemolizado.

 ·5: Cuando haya penetrado todo el hemolizado añadiremos 200 μL del reactivo 2, intentando arrastras posibles restos de antes y desechamos el eluido, y pipeteamos 2 (mL) del reactivo 2, dejamos que se filtre todo el volumen y desechamos el eluyente

 ·6: Despegamos la Hb glicosilada de la columna y la depositamos en un tubo de ensayo, cogiendo 4 mL de reactivo 3 y lo depositamos en la columna, quedándonos esta vez con el eluyente, ya que ahí estará presente la hemoglobina glicosilada objetivo de estudio

 ·7: Ahora tenemos que preparar el patrón que vamos a usar en el espectrofotómetro, mientras que el líquido que contiene la hemoglobina glicosilada va cayendo en el tubo de ensayo.

 Cogemos 12 mL de reactivo 3 y 50μL de hemolizado, esta muestra esta demasiado concentrada, por lo que tenemos que diluirla para que cumpla la ley de Lambert-Beer

 Resultado:

 Ahora que ya tenemos todo el procedimiento realizado, debemos medir con el espectrofotómetro , con una longitud de onda de 415 nm. Previamente tenemos que hacer un blanco con agua destilada, para eliminar las impurezas. Ahora que hemos medido las absorvancia nos dan estos datos:

- A. muestra = 0.249 nm
- A. patrón= 0.642 nm

 Y con estos datos tenemos que calcular el porcentaje de hemoglobina glicosilada de la muestra siguiendo la fórmula

(A. muestra/ 3x A. patrón) x100 = % Hb A1c
(0.249/ 3x 0.642) x100 = 12.93%

Galería:

Separación De Una Mezcla De Aminoácidos Por Cromatografía En Capa Fina

Separación De Una Mezcla De Aminoácidos Por Cromatografía En Capa Fina

 Objetivo:

 Nuestro objetivo en esta práctica es intentar hacer una separación de los componentes de una mezcla y poder identificarlos. Para ello vamos a emplear la técnica de cromatografía en capa fina la cual es una técnica de separación de disoluciones que utiliza una fase móvil que se mueve a través de una fase estacionaria que es absorbente. No obstante dichas fases serán de un material u otro en función de la sustancia que queramos separar. Esta técnica emplea el método de capilaridad a la hora de arrastrar la muestra; en función de cada molécula está adoptará una posición u otra, gracias a esto podemos clasificar dichas moléculas

 Materiales:

-       Lámina de gel de agarosa

-       Disolvente de cromatografía

-       Disolución reveladora

-       Muestra problema con cantidad desconocida de aminoácidos

-       Muestra de patrón

-       Cubetas

-       Atomizador

 Procedimiento:

 ·1: Primero tenemos que colocar el disolvente en la cubeta

 ·2: Coger una placa de celulosa la cual tenemos que manipular con mucho cuidado para no dañarla, y después de recortar esta placa con las medidas adecuadas (10X5)

 ·3:  Realizar dos marcas en la placa a una distancia de 1,5 Cm entre si, y a una altura de 1 cm. A continuación tenemos que poner 2 microlitro de la muestra en un punto y en el otro otros dos microlitros del patrón, después tenemos que secar bien la muestra

 ·4: Cuándo ya se hayan secado la muestra, tenemos que poner la placa de celulosa sobre la base de la cubeta pero respetando siempre que la muestra este por encima del líquido disolvente. Luego tenemos que taparlo con la tapa y que así pueda subir el disolvente por capilaridad

 ·5: Cuando haya subido unos 8 cm, debemos retirar ya la placa de la cubeta,secar y marcar con lápiz hasta donde haya llegado la fase móvil y lo secamos en la estufa

 ·6: Ahora que la placa está seca, debemos echarle el revelador ya que lo que tenemos delante nuestra es una placa transparente y vamos a teñir hasta donde han llegado los componentes

 ·7: Por últimos vamos a calentar la placa a unos 105º durante dos minutos y tras este periodo de tiempo, vamos a comprobar cómo se han teñido perfectamente las manchas de aminoácidos

 Resultados:

 Ahora que ya hemos hecho la práctica, hemos medido hasta donde han llegado las marcar como ya hemos planteado antes y realizaremos la siguiente fórmula, para ver cual es la relación frente soluto, la cual es única de cada molécula y asi ver con que componente estamos trabajando.

Rf= Distancia recorrida por el compuesto desde el origen 

       Distancia recorrida por el eluyente desde el origen

 Galería:

Cuantificación De Proteínas En Orina Con Ácido Sulfosalicílico Por Turbidimetria

Cuantificación De Proteínas En Orina Con Ácido Sulfosalicílico Por Turbidimetria

 Objetivo:

 En esta práctica vamos a ver la cantidad de proteínas que hay en una muestra de orina. Para ello vamos a añadir ácido sulfosalicílico a una solución de proteínas , originando precipitaciones en la propia muestra. Este precipitado se ve con gran turbidez, cuya intensidad se puede cuantificar mediante el uso del espectrofotómetro y averiguar la concentración de proteínas presentes.

 Materiales:

-       Tubos de ensayo de 10 mL

-       Cubetas de fotometría

-       Espectrofotómetro

-       Equipamiento habitual de laboratorio

 Procedimiento:

 ·1: Rotulamos todos los tubos de ensayo; al primero le ponemos BR (Blanco de reactivo), otro como BM (Blanco de muestra) , los siguiente cuatro les escribimos P1,P2,P3,P4 y para concluir al último le ponemos PB(Problema)

 ·2: Ahora tenemos que preparar las disoluciones,que vamos a emplear:

     D1- 1/50 (0,2 ml de patrón + 9,8 ml de SSF)= 140 mg/dL

     D2-1/100 (0,1 ml de patrón + 9,8 ml de SSF)= 70 mg/dL

     D3-1/200 (0,05 ml de patrón + 9,8 ml de SSF)= 35 mg/dL

     D4-1/400 (0,025 ml de patrón + 9,8 ml de SSF)= 17,5 mg/dL

 ·3: A continuación tenemos que rellenar los tubos que hemos rotulado previamente siguiendo esta tabla:

	BR	P1	P2	P3	P4	BM	PB
Suero fisiológico	0,5	--	--	--	--	2,0	--
D1	--	0,5	--	--	--	--	--
D2	--	--	0,5	--	--	--	--
D3	--	--	--	0,5	--	--	--
D4	--	--	--	--	0,5	--	--
Orina	--	--	--	--	--	0,5	0,5
Ácido sulfosalicílico	2,0	2,0	2,0	2,0	2,0	--	2,0

    (Todo en mL)

 ·4: Después agitamos los tubos por inversión y lo pasamo a las cubetas para su posterior uso en el espectrofotómetro

 ·5: Colocamos el espectrofotómetro en 660 nm y realizamos un blanco con el BR para calibrar. Medimos la absorbancia de P1,P2,P3,P4

 ·6: Ajustando a cero el fotómetro con el BM y a continuación medimos la absorbancia del PB

Resultados:

 Una vez que ya hemos realizado todos los procedimiento necesarios, hemos obtenido las siguientes absorbancias:

0,419	P1
0,178	P2
0,117	P3
0,038	P4

 Con estos datos tenemos que hacer una curva de calibración para poder meter la absorbancia de PB1 y de PB2 y ver qué concentración corresponde.

PB1	0,777
PB2	1,507

 No obstante como los datos son demasiados elevados, tuvimos que hacer una dilución de la muestra al 1/2 . Hechando 2,5 mL de suero fisiológico a la muestra, por lo que las absorbancia actuales son: PB1=0,266 y PB2= 0,667

 Al pasarlo a la curva podemos decir que PB2 tiene una concentración proteica de 165 mg/mL  y el PB1 tiene una concentración de 108 mg/mL.

 Galería:

Determinación de la glucemia por el metodo de la hexokinasa

Determinación de la glucemia por el metodo de la hexokinasa

 Objetivo:

  En este ejercicio vamos a intentar determinar la cantidad de azúcar de una muestra; como

 la práctica anterior. No obstante ahora vamos a emplear otro método diferente. Basándonos en la capacidad de catalización de la fosforilación

 de la hexokinasa sobre la glucosa, provocando glucosa-6-fosfato, esta es reducida por la G6F-DH y origina NADH pariendo del NAD. El aumento de la  concentración de la NADH es proporcional a la concentración de glucosa que tiene la muestra.

 Materiales:

-       Espectrofotómetro a 340 nm

-       Cubeta de 1 cm

-       Equipamiento habitual

Procedimiento:

 ·1: Primero tenemos que preparar los reactivos de trabajo que vamos a emplear. Para ello vamos a vertir las enzimas que vienen en el kit sobre el tampón que también podemos encontrar en el mismo. 

 ·2: Ajustamos el espectrofotómetro  y realizamos un blanco para eliminar todas las posibles alteraciones que nos puedan falsear los datos

 · 3: Preparamos las cubetas siguiendo esta tabla;

	Blanco	Patrón	Muestra
Reactivo Trabajo (ML)	1	1	1
Patrón	---	10	---
Muestra	---	---	10

 ·4: Mezclamos e incubamos 5 minutos a 37º

 ·5: Por último, leemos la absorbancia del patrón y la muestra

 Cálculos:

 Tras haber hecho todo el procedimiento y haber hayado las observancias objetivos de estudio tenemos que hacer la siguiente fórmula para calcular la cantidad de glucosa en la muestra:

(A)  Muestra   X 100= mg/dL

(B)  Patrón

  Cuando sustituimos la fórmula por los datos nos dice que la muestra tiene un nivel de glucosa de 228,08 mg/dL

Galería:

Determinación De La Glucemia Por El Método De La Oxidasa-Peroxidasa

Determinación De La Glucemia Por El Método De La Oxidasa-Peroxidasa

 Objetivo:

 En esta práctica vamos a hacer la determinación de la glucosa, para ello vamos a intentar catalizar la glucosa oxidasa a ácido glucónico; originando H2O2 que podemos detectar con un aceptor cromogénico. En función de la intensidad formada podremos ver la glucosa presente en la muestra, ya que es proporcional

 Materiales:

-       Espectrofotómetro a 505 n,m

-       Cubetas de 1 Cm que dejen pasar la luz

-       Equipamiento habitual del laboratorio

 Procedimiento:

  ·1: Lo primero que tenemos que hacer es preparar los reactivos de trabajo; para ello vamos a coger las enzimas (R2) que vienen en el kit y las echamos sobre el tampón (R1).A continuación lo mezclamos  hasta disolver totalmente el contenido

 ·2: Realizamos un blanco en el espectrofotómetro empleando agua destilada

 ·3: Preparamos las cubetas para la práctica, siguiendo esta tabla:

	Blanco	Patrón	Muestra
Reactivo Trabajo (ML)	1	1	1
Patrón	---	10	---
Muestra	---	---	10

 ·4: Mezclamos e incubamos 10 mins. a 37º

 ·5: Leemos la absorbancia del patrón y de la muestra con el espectrofotómetro

 ·6: Tras recabar todos estos datos necesarios tenemos que hacer los datos pertinentes, siguiendo esta fórmula:

(A) Muestra   X 100= mg\dL de glucosa en muestra

(A) Patrón

 A la hora de hacer esta práctica, comprobamos que (A) Muestra= 0,756 y que (A) Patrón= 0,285

 Por tanto al pasarlo por la fórmula anterior, vemos que la cantidad de glucosa en la muestra es de 265,26 mg\dL

Galería: